Analyse de données MNase-seq et ChIP-seq

Results

A preprint is available

(Condensin positioning at telomeres by Taz1 promotes telomere disjunction in anaphase)[https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.03.18.484892.abstract]

Analyses bio-info pour soumission de manuscrit en urgence

Porteur du project

Pascal Bernard

Personnes

Pascal Bernard, Léonard Colin, Esther Toselli, Laurent Modolo

Problématique biologique (et de publication en l’occurrence)

Les complexes SMC (e.g. condensine et cohésine) sont des organisateurs du génome. De récentes études in vitro montrent que condensine et cohésine sont des ADN-translocases qui utilisent l’énergie issue de l’hydrolyse de l’ATP pour former et agrandir des boucles d’ADN. Des données in vivo confirment que condensine et cohésine organise le génome en mitose et cohésine en interphase, respectivement, en formant des boucles de chromatine. Les SMC apparaissent donc comme une nouvelle classe d’ADN-translocases qui organisent le génome en 3D par un processus d’extrusion de boucles d’ADN. Une question importante dans le champ consiste désormais à savoir comment les SMC opèrent dans le contexte de génomes chromatinisés, et notamment quel est l’impact des nucléosomes sur l’activité de loop-extrusion des complexes SMC. Nous avons attaqué cette question chez la levure S. pombe en analysant l’impact des nucléosomes sur le fonctionnement de condensine en mitose. Les résultats de Léonard (étudiant en thèse) et d’Esther indiquent clairement que les nucléosomes sont un obstacle à l’activité de condensine in vivo.

Brièvement, FACT est une chaperonne d’histone qui ouvre et ferme les nucléosomes, assurant ainsi la fluidité de la chromatine. Par MNase-seq calibrée nous observons une augmentation de l’accessibilité à l’ADN internucléosomal en métaphase chez le mutant pob3∆ comparé au contrôle WT. Par Hi-C, nous observons une augmentation de la fréquence des contacts 3D en mitose, i.e. assurés par condensine, chez le mutant pob3∆ vs WT. Enfin, et de façon cruciale, ni la position ni la quantité de condensine le long du génome ne semble modifiée dans les cellules pob3∆ vs WT (ChIP-seq calibrée condensine en métaphase). Cependant, par la même technique, nous observons bien une réduction du binding de condensine chez le mutant cut3-477 traité en parallèle et utilisé comme contrôle. Et cette réduction s’accompagne d’une diminution de la fréquence des contacts mitotiques mesurés par Hi-C. Ces conclusions sont tirées de l’examen visuel minutieux de nos données brutes de MNase-seq et de ChIP-seq. Il semble donc que les nucléosomes (maintenus par Pob3/FACT en mitose) sont un obstacle à l’activité de condensine in vivo. Il nous reste quelques analyses bio-info à effectuer et serons en measure de soumettre un manuscrit qui, nous l’espérons, pourrait avoir un fort impact dans le champ des SMC.

Un manuscrit compétiteur vient d’être déposé sur BioRixv (bioRxiv 2021.09.15.460217; doi: https://doi.org/10.1101/2021.09.15.460217). Il s’agit d’un travail in vitro qui arrive aux mêmes conclusions que les nôtres. Nos travaux (in vivo et in vitro) sont donc complémentaires. J’ai contacté Luis Aragon, le corresponding author, que je connais : le manuscrit vient d’être soumis et n’est pas encore passé la barre éditoriale. Nous avons convenu d’une stratégie de co-publication à horizon d’un mois, un mois ½. Tenir cet objectif implique que nous achevions l’ensemble de nos analyses bio-info dans ce délai très court. Nous travaillons à réaliser ces analyses nous-mêmes, mais notre relative inexpérience en la matière est clairement un handicap pour réussir une co-publication. Nous sollicitons donc l’aide de Laurent en urgence pour la réalisation d’une partie des analyses.

Données

Disponibles :

- MNase-seq calibrée (nucléosomes) ; 2 réplicats bio et techniques

- ChIP-seq calibrée (condensine) ; 2 réplicats bio et techniques

- Hi-C ; 2 réplicats bio et techniques

Toutes les données ont été acquises en métaphase, sur cellules WT ou mutantes, et sont donc directement comparables. Les données de Hi-C sont analysées par Léonard et plus finement pas l’équipe d’Olivier Cuvier (CBI-Toulouse) avec laquelle nous collaborons.

En cours :

Deux jeux supplémentaires de données de ChIP-seq calibré condensine (wt, pob3D et cut3-477). Les libraries sont fabriquées aujourd’hui. Le séquençage devrait débuter semaine 40 et les données être disponibles semaine 44. Ces données pourraient venir consolider les deux jeux de ChIP-seq calibrées existants.

Nous sollicitons l’aide de Laurent pour :

(1) L’analyse des données de MNase-seq calibrée en soutien à Léonard. L’objectif est de décrire l’occupancy et le positionnement des nucléosomes chez pob3D vs WT en mitose, aux sites occupés par condensine vs sites non-occupés par condensine. Léonard tente actuellement d’analyser les data avec le pipeline DANPOS 2, mais il est clair que nous gagnerions en efficacité avec l’aide de Laurent. Les données à produire sont :

- Metaplots of normalized nucleosome density centered at the TSS +1 nucleosome or at the TTS -1 nucleosome. The plots will include a ±1 kb region sur-rounding the +1 or -1 nucleosome.

- Heatmaps of fold change between pob3D versus WT nucleosome density centered at the TSS +1 nucleosome.

(2) L’analyse des données de ChIP-seq calibrées condensine. La pierre angulaire de notre travail consiste à déterminer sans ambigüité si l’augmentation de la fréquence des contacts 3D en mitose que nous observons chez pob3D s’accompagne, ou non, d’une modification du pattern de localisation de condensine. L’examen visuel minutieux avec IGV de nos deux jeux de données de ChIP-seq calibrée contre condensine chez WT, pob3D ou cut3-477, montre une baisse nette du binding de condensine chez cut3-477, comme attendu, mais aucun changement chez pob3D vs WT. Nous avons besoin de l’expertise de Laurent pour formaliser cette analyse et se convaincre de la pertinence des résultats.

Il s’agira de comparer le nombre, la position et la taille des pics condensine entre pob3D vs WT, et entre cut3-477 vs WT, et attribuer une valeur statistique aux modifications observées.

Date

La date du début du project : au plus vite.
La date d’obtention des données : toutes disponibles
La date souhaitée de fin du project : d’ici 1 à 5 mois, maximum